Adelfas: Oleandrigenina, molécula mortal

¿Me echabais de menos? Después de un más que largo descanso veraniego, vengo con un conjunto de historias que giran en torno a una planta muy común, que todos conocéis y que es mortal de hojas a tallo.

Para adelantaros un poco, os diré que enlazaremos la época griega y romana, con su parte de mitología y superstición, con la literatura y el cine, y con la ciencia forense. ¿Os apetece?

Bien, empezaré por deciros que tenía varias ideas antes de este post pero que, por caprichos del destino, todo me llevaba una y otra vez a la planta protagonista. Por tanto, decidí dejar los demás e intentar hilar toda la información y leyenda alrededor de ella.

La planta en cuestión es la Adelfa, un bello arbusto con hojas afiladas y flores muy parecidas a las rosas. De hecho, su nombre en griego es neriom y en latín Nerium, que se relaciona con Nereus, dios del mar y padre de las Nereidas. También la conoceréis como rododendro o rododaphe (rodo, de rosa y daphe, de laurel) y a la flor, rosa de laurel.

Ya por la época griega, Dioscórides la describe como una planta cuyas hojas y flores son veneno mortífero para los perros, los asnos, los mulos y muchos animales cuadrúpedos. Aunque recoge la creencia de que mezclada con vino, actúa como antídoto para mordeduras de fieras.

¿Y quién es Dioscórides? Pues este caballero era un ciudadano griego del siglo I-II. Un amante de la naturaleza, que dedicó su vida a la recopilación de todas las plantas presentes en Grecia y Roma. Sus magníficas descripciones permitieron que, durante el oscurantismo de la Edad Media, los monjes escribanos lograran identificarlas con plantas conocidas en Europa y su consecuente ampliación de dibujos. Eso sí, también acompañaba a sus descripciones con los supuestos poderes de las plantas, la mayoría fruto de la creencia popular y sin que él ni ningún sabio contemporáneo suyo lo intentara demostrar. ¿Por qué? Porque en Grecia, la experimentación estaba muy mal vista, se creía y punto.

Sí amigos, eran grandes sabios y eruditos pero la experimentación para demostrar sus principios distaba mucho de ser real y palpable.

(Dioscórides)

De tal modo que el propio Dioscórides recoge, en su obra, el episodio que sufrió Apuleyo con las Adelfas cuando vivía bajo forma de asno. Tranquilos, os explico:

Apuleyo,  nacido en Madauras en el s. II d.C. fue un escritor bilingüe (griego y latín) muy culto, entregado al cultivo de las Nueve Musas, al de la Filosofía y al «saber científico», que llegó a ser nombrado Sacerdote de la Provincia de Cartago y que recibió honores oficiales, además de erigirse estatuas en su honor. Su obra «El Asno de oro» está disponible a día de hoy y en ella, Apuleyo narra la vida de Lucio (muchos dicen que es autobiográfica y de ahí la confusión de escritor-protagonista) quien, por avatares del destino, llega a ser convertido en asno.

(Apuleyo)

Si vamos al Dioscórides, éste recoge «cuando el pobre Apuleyo fue convertido en asno y pretendía comer rosas para que le volvieran a su prístina forma humana, por poco no salió engañado con la de las adelfas, porque, habiéndolas divisado desde la lejanía, imaginando que lo eran de verdad, con tales ansias se echó a correr para devorarlas, que poco faltó para que las comiera sin detenerse a mirarlas. Más, entonces cayó en la cuenta que eran veneno presentáneo y mortífero para los asnos, y hallándose que él lo era, burlado por la Fortuna, dejó las adelfas en paz y volvíose con las orejas gachas«. (pág. 733 del Dioscórides renovado).

(mural sobre El Asno de Oro)

Y si vamos al libro «el Asno de oro», podemos leer tanto cómo se convierte en asno cómo el episodio con las falsas rosas.

Metamorfosis a Asno:

Realmente, Lucio (Apuleyo) quiere convertirse en ave para volar libre y huir de un juicio por homicidio; así que recurre a Fotis, la sirvienta de una hechicera. Pero Fotis se confunde de caja y…

«Yo recojo esa cajita con ambas manos y la cubro de besos, en primer lugar la conjuro para que me otorgue el favor de un vuelo feliz, al instante me despojo de toda mi indumentaria y meto ansiosamente las manos dentro; saco un poco más de ungüento y me froto a fondo todos los miembros de mi cuerpo. El ardiente deseo de ser un ave me lleva a mover alternativamente mis brazos; no aparece el menor síntoma de pelusa ni plumas; la clara realidad es que mis pelos se endurecen como cerdas, mi suave cutis adquiere la rigidez del cuero; en mis extremidades no se pueden ya contar los dedos, pues cada miembro termina en una sola uña; y en la última vértebra me sale una larga cola.

Mi rostro pierde toda proporción: me crece la boca, se me ensanchan las narices, me cuelgan los labios; de la misma manera se cubren de pelo y se desarrollan exageradamente las orejas. En la triste metamorfosis, como único consuelo veo que, si bien, ya no puedo tener a Fotis en mis brazos, se abrirían para mí nuevas posibilidades naturales (…). Fotis se lamenta: «Pobre de mí, ¡estoy perdida! El miedo y la precipitación han hecho que me equivocara; el parecido de las cajas ha originado mi confusión. Por suerte es bastante fácil hallar un remedio a esta metamorfosis: pues te bastará masticar unas rosas y dejarás de ser asno para volver a ser en el acto mi querido Lucio».» (págs. 73-74)

(Apuleyo-Lucio, gozándola de Asno)

Como véis, Dioscórides sí acierta al decir y plasmar que son venenosas pero sólo para los animales y como referencia, coge la fantasiosa historia de Apuleyo como prueba verídica de ese saber popular. (No os pongo el pasaje de cómo Lucio se extasia al divisar las adelfas y reacciona a tiempo porque es repetir lo escrito por Dioscórides).

Aquí podríamos hacer un parón y reflexionar. Tenemos un libro del s. II d.C. en el que se recogen las propiedades de las plantas, así como una gran descripción que nos permitió la clasificación posterior pero, en muchos casos, no hay fundamento alguno en sus usos como venenos, cataplasmas o remedios medicinales que sean veraces. De hecho, como anécdota recupero el caso de la consuelda y cómo la creencia en sus propiedades llegó al siglo XVII.

Según la tradición popular (de tiempos de Dioscórides también), la consuelda sirve para unir (soldar) la carne. Para ver si ésto es verdad o no, hubiese bastado con coger un trozo de carne, cortarlo en dos y echarle la infusión de consuelda para, acto seguido, ver como el trozo de carne se recompone. Sin embargo, como la experimentación estaba vetada, Dioscórides se limitó a recoger esta información.

Así, llegamos a un libro de Fitoterapia del s. XVII donde se cuenta que una sirvienta quiso recuperar su virginidad preparándose un baño con dicha planta. La dama a la que servía decidió que quién se bañaba era ella, ajena al remedio, y se dice que, esa noche, el marido dio cuenta de la recuperada virginidad de su esposa. Podéis reíros pero está recogido bibliográficamente.

¿Podemos fiarnos, entonces, de los saberes antiguos y populares, incluso de los textos de reconocidos sabios? Por suerte, la experimentación y el estudio llegaron para alumbrarnos y, desde hace unos siglos, podemos estudiar la composición y efecto de las plantas, así como aislar y modificar sus principios activos para beneficiarnos de sus usos terapéuticos.

Al contrario que con la consuelda, la mortal acción de las adelfas está constatado y no sólo ha proporcionado un tema para la literatura y el cine, sino que os mostraré un caso forense (dado en una de las asignaturas de la licenciatura) real en el que la sospecha de un envenenamiento por adelfa no estaba descartada, en absoluto.

Aparte, existe la leyenda (no he podido constatar si es verídico o no) de que un regimiento de Napoleón usó estacas de este arbusto para asar lo que habían cazado y decenas de soldados murieron intoxicados.

Si tenéis curiosidad, la película «La flor del mal» es la adaptación cinematográfica del libro homónimo en el que, ya en el primer párrafo, nos encontramos con esta descripción:

«El viento de Santa Ana venía cargado con el calor del desierto y marchitaba las últimas hierbas de la primavera.

Sólo las adelfas prosperaban, sus delicadas flores venenosas, sus hojas verdes en forma de puñal».

En la novela, la bellísima Ingrid (Michelle Pfeiffer en el film) se siente herida y rechazada por el último de sus amantes, un hombre vulgar que la reemplaza por otra menos hermosa, y decide vengarse. Así lo narra su hija, protagonista del libro:

«Él cambió las cerraduras de su casa. Tuvimos que usar una regla de metal para abrir una ventana. Ésta vez ella puso una rama de adelfa en su leche, otra en su salsa de ostras, en su queso cottage. Puso una en su dentífrico. Hizo un arreglo de adelfas blancas en un jarrón en su mesa ratona, y roció pimpollos en su cama. Yo estaba desgarrada, él merecía un castigo pero mi madre había cruzado la frontera» (pág. 48).

(fotograma de la película)

Y tras todo ésto, vamos con la planta en sí, su composición y el caso forense al que la policía científica tuvo que enfrentarse.

 Adelfa

La parte que se usa como droga está en las hojas (Oleandri folium). Éstas se caracterizan por contener heterósidos cardiotónicos  de tipo cardenólido (en un 1’5%), siendo el principal: la oleandrina.

Oleandrina (en la oleandrigenina, el grupo funcional sería un -OH)

La oleandrina es un L-oleandrósido de la oleandrigenina, cuya estructura guarda una gran analogía con los heterósidos digitálicos.

Sí, explico.

-heterósido: Los glucósidos o heterósidos son compuestos que están formados por 2 partes: una es un  azúcar (ej. glucosa) y la otra de no-azúcar o aglicona, aglicón o genina. El enlace entre ambas es hidrolizable y debe romperse para que se active el compuesto; esta ruptura es catalizada por fermentos que contiene la misma planta. Se clasifican de acuerdo a las características estructurales de la parte no-azúcar o aglicón. Su nombre termina en –ósido, aunque algunos mantienen su nombre tradicional acabado en –ina (por ejemplo, digitoxina).
Constituyen los principios activos de muchas plantas y su actividad farmacológica se debe fundamentalmente a la parte no glucídica.

-cardiotónico: principios activos que actúan directamente sobre el músculo cardíaco y, por tanto, ejercen su acción terapéutica en la insuficiencia cardíaca congestiva o en las alteraciones del ritmo cardíaco. Sin embargo, precisamente por la gravedad de esta patología y las características especiales de estos principios activos, cuyo margen terapéutico es sumamente estrecho, muchas de las drogas que los contienen no se emplean, en la actualidad, directamente como productos fitoterapéuticos aunque sus principios activos aislados siguen siendo de gran importancia en terapéutica.

Acción farmacológica

A bajas dosis es cardiotónico, ésta actividad se debe a la oleandrina, la cual presenta un mecanismo de acción común con otros heterósidos cardiotónicos como la digoxina y digitoxina.

¿Cómo funcionan? La oleandrina inhibe la bomba Na+/K+ dando lugar a un aumento en la concentración intercelular de Na+. Ésto activa un mecanismo alternativo de evacuación de Na+ a través de su intercambio con Ca2+, mediante una proteína de membrana específica. El resultado neto es el aumento de los niveles intracelulares de Ca2+, lo que desata una serie de procesos bioquímicos cuyo resultado final es un aumento en la fuerza de la contracción del miocardio

Precauciones a tener en cuenta:

Es una planta altamente tóxica. Su intoxicación es similar a la digitálica (ésto, como veremos más tarde, ayuda a la «detección» de oleandrina. Los primeros síntomas se manifiestan a nivel digestivo con nauseas, vómitos y diarrea, acompañados de sintomatología neurológica como malestar, debilidad, vértigo, confusión mental y trastornos de la percepción. A continuación, aparecen los efectos sobre el corazón que son bradicardia y pulso débil e irregular.

Tratamiento

Dependerá del desarrollo de la intoxicación. Desde un vaciado gástrico, si la ingesta es reciente. Hasta el uso de atropina intravenosa para la bradicardia y un poco de glucosa o insulina, vía intravenosa, para restablecer los niveles de potasio. Por último, se administran fragmentos Fab de anticuerpos antidigoxina, que parece dar buenos resultados.

Caso Forense

En 1985, el joven dueño de una funeraria muere por «aparentes» causas naturales. A pesar de su juventud, padecía sobrepeso y llevaba una vida muy estresante. Por tanto, el caso se cerró.

Sin embargo, en 1991, un antiguo empleado, afirmó tener serias dudas sobre aquella muerte. Dijo que el joven podría haber sido asesinado, por alguien de la competencia, utilizando las adelfas para envenenarle. Ante este testimonio, el caso fue reabierto y, de confirmarse el homicidio, el sospechoso podría ser sentenciado a pena de muerte.

Lo que se hizo fue recuperar los tejidos que sobraron de la autopsia y determinar si podía identificarse o no la oleandrina o compuestos relativos a ésta: oleandrigenina, en concreto.

Los primeros ensayos rutinarios, no cuantitativos, como cromatografía en capa fina (TLC) y radioinmunoensayo (RIA), procedentes de dos laboratorios independientes, indicaron la posible presencia de oleandrina.
A causa de ésto, tanto los abogados de la defensa como de la fiscalía, requirieron evidencias definitivas basadas en el uso de técnicas analíticas más específicas.

-Defensa: contrató a un especialista en toxicidad para que revisara los estudios científicos incriminatorios disponibles y recomendara qué métodos pudieran ser definitivos para demostrar la inocencia del acusado. El especialista concluyó que los resultados no eran suficientes como prueba concluyente, porque la técnica utilizada rutinariamente, en importantes casos forenses, era generalmente CG/MS (Cromatografía de gases y espectrofotometría de masas).

-Fiscalía: decidió requerir evidencias definitivas y datos más precisos para reforzar su acusación. (Aunque con los preliminares, el caso iba a su favor).

Tanto el experto de la fiscalia como el de la defensa, dieron el nombre de un experto científico como fuente adicional para resolver el caso. A pesar de la recomendación, antes de dar el paso, les preguntaron si la técnica del atomizador de iones/CL/MS era la adecuada para afrontar el problema.

Se acordó que la búsqueda se limitaría a la oleandrina y su aglucón (oleandrigenina). Y realizaron las pruebas.

(Aquí comienza el paseo por técnicas y datos. Lo sé… pero seguid, ¡ánimo!)

Se compraron patrones de ambos y se prepararon las disoluciones para hacer el análisis CL y la detección con UV y CL/MS. Al mismo tiempo, se pincharon muestras de hígado bovino que contenían los dos compuestos, para realizar con ello el procedimiento de extracción.

Para no dudar de la selectividad, se colocó un segundo MS a la serie. Y se llevaron a cabo experimentos preliminares para ver si la técnica cumplía los requisitos de selectividad y sensibilidad necesarios.

Para cada compuesto, obtuvieron el espectro de masas de disociación inducida por colisión, algo que se consiguió mediante la inyección de cada analito disuelto en CH3OH/H2O (50/50, v/v) conteniendo 5mM NH4OAC. El último compuesto que fue añadido fue un agente de desorción para MS con ionización electroatómica. De este modo, el aducto del ión amonio debía ser atacado por los grupos polares y neutros presentes en la oleandrina y oleandrigenina.

Dichas moléculas deberían convertirse en moléculas protonadas debido a la presión atmosférica de ionización (con gas Argón P= 2.1014 atm/cm2) o por disociación inducida por colisión (CDI) en el espectrofotómetro de masas, si en la preselección antes del masas se perdiera NH3 neutro.

Se observaron dos moléculas, una con un pico m/z 577 (oleandrina) y m/z 433.1 (oleandrigenina). El espectro de masas obtenido es la huella digital para cada compuesto y proporciona, por tanto, una identificación inequívoca.

En base a estos resultados con el hígado bovino, se aceptó el reto analítico que se les había presentado.

Análisis de tejidos corruptos

Tanto defensa como fiscalía mandaron muestras de tejidos corruptos al experto (el Dr. Cornwell), de tal  modo que hubiera dos estudios independientes y se pudieran comparar los resultados obtenidos.

Las dificultades aparecieron muy pronto por el alto grado de descomposición de los tejidos y se tuvo que recurrir a literatura para encontrar un protocolo adecuado y/o correcto. Dada la previa experiencia, el análisis de tejidos para residuos con trazas de agentes promotores de tumores, volvieron al procedimiento de extracción líquido- líquido.

Para la extracción se usa una mezcla solvente consistente en acetonitrilo, agua, hexano y diclorometano: se forman tres fases distintas que separan a los analitos por polaridad. De modo que los de interés se encontrarían en la fase del acetonitrilo, en el medio. Mientras que las grasas y otros materiales quedarían en el hexano, en el fondo.
La capa de acetonitrilo se separa, se concentra y se somete o bien a extracción en fase sólida (SPE) o Cromatografía líquida doble (CL/CL). Ésta última ofrece automatización y da una selectividad considerable. Por esta razón, se optó por este método, al que se le acoplaría un sistema MS/MS.

Para el caso en cuestión, se tomó 1g de tejido humano y le añadieron 30 ppb (partes por billón) de oleandrina y oleandrigenina. Los problemas llegaron muy pronto a la hora de purificar muestra y patrón, puesto que la adipocera (que aparece en el proceso de descomposición) quedaba retenida en el cartucho. Además, esta adipocera (también conocida como «cera blanca de lápida») es una mezcla de ácidos grasos muy difícil de separar de los analitos que interesaban.

El paso de la extracción en fase sólida se lo saltaron e inyectaron los extractos de la muestra, tras filtrarlo, en la columna de CL.

El resultado indicaba muchas interferencias químicas en la región de la oleandrina, por lo que se acopló un sistema de HPLC de 3 columnas, dos válvulas de inyección y dos sistemas de bombeo. Con ésto se consiguió un cromatograma con una línea de fondo reconocible con picos definidos a un t= 7.9 esperado para la oleandrina; pero este éste está enmascarado por altos niveles de otros compuestos de la matriz.

Consiguieron mejorar las condiciones, pero no se alcanzó la selectividad requerida. Algo que podría haberse conseguido, de tener más tiempo, mediante un experimento alternativo como mejorar la purificación de la muestra después de la extracción inicial usando distintas fases estacionarias en las columnas de HPLC o utilizar sistemas de detección más específicos.

Sin embargo, a una semana del juicio, tuvieron que optar por un sistema CL/CL pero optaron por reemplazar el detector UV por API (inmunoensayo) con tres cuadruplos simultáneos. Por tanto, al final se utilizó la cadena CL/CL/MS/MS con el que se obtuvo un único pico para la oleandrina con interferencias.
Se obtienen una proporción relativa (de iones y compuestos) esperada para la molécula de estudio, por lo que su presencia SÍ quedaba demostrada.

Diagrama del sistema de cuadruplos

No obstante, realizaron las soluciones de los recipientes donde estuvieron contenidos los tejidos y no se probó la presencia de estos analitos. ¿Por qué? Hay tres posibles explicaciones para los resultados negativos:

1) El fallecido podía no haber sido envenenado con oleandrina

2) Las moléculas de oleandrina y oleandrigenina podían, fácilmente, haber sido rotas por degradaciones químicas y microbiológicas, obteniéndose otros productos que no habrían sido identificados con su método.

3) Habían detectado niveles de 30 ppb, pero, en las muestras problema los analitos podrían encontrarse en niveles más bajos, ya que las muestras problema habían permanecido a temperatura ambiente durante largo tiempo.

Análisis de extracto de adelfa

Acompañando a las muestras de tejido humano estaba una muestra de extracto de hojas de adelfa. Y los abogados requerían el análisis de esta muestra para compararlas con el análisis del tejido humano. La suposición lógica en este caso era que otro glicósido cardiotónico de la planta podía ser detectado en el tejido humano, si la muerte hubiese sido debida a una ingestión de adelfa.

Una revisión en la literatura, mostraba que había más de una docena de glicósidos cardiotónicos en la planta. Los datos de CL/CL con un detector UV muestra una mezcla demasiado compleja con significativas interacciones.  Pero en el CL/CL/MS/MS, los perfiles confirmaban la presencia de oleandrina a 7.3  min. Además, en el extracto se encontraron otros dos compuestos con la misma masa que la oleandrina pero diferentes tiempos de retención. Estos compuestos se identificaron como cryptogradosida A y nerigosida.

¿Podría haber cambiado el resultado de haber buscado éstos dos metabolitos? No podemos afirmarlo con seguridad pues, como veis, realizar el estudio en tejidos que llevan tanto tiempo descompuestos es muy complicado. De hecho, el caso se cerró por no poder demostrar el envenenamiento o bien, por que no lo hubo o porque el método no fue el acertado.

A día de hoy, teniendo en cuenta el paso de 23 años, es de esperar o suponer que el procedimiento se haya perfeccionado, si bien no he podido acceder a ningún caso forense parecido (lo que, de verdad, me alivia bastante).

Dudaba entre relataros el estudio forense o no porque no se llegó a una conclusión concisa y el caso no se resolvió. Pero decidí compartirlo para que veáis la inventiva que muchas veces se necesita y la importancia de establecer protocolos. El reto de perfeccionar métodos y protocolos forma parte de la evolución en análisis y todo profesional puede encontrarse con ellos. Muchas veces, el tiempo corre en contra o los recursos no son los adecuados, pero éstos casos sólo sirven para saber por dónde no ir y obligarnos a pensar en cómo mejorar.

Buscando bibliografía, me he encontrado con casos actuales en los que han recibido en Urgencias, de países tan dispares como China, EE.UU. y España, a pacientes que aseguraban haber utilizado o infusiones o extracto de adelfas como autolíticos (agentes suicida). En todos los casos, se refería la falta de un sistema o método para poder obtener resultados cuantitativos de la sustancia y el uso de pruebas referidas a digoxina, metabolito con el que la oleandrina tiene una reactividad cruzada.

Los médicos se encuentran con que en los hospitales no está disponible el sistema de HPLC/MS para detectarlo y deben recurrir a otros procedimientos como

-Inmunoensayo para digoxina TDx (FPIA)

-enzimoenmunoanálisis de micropartículas (MEIA)

-ensayo de quimioluminiscencia (CLIA)

El problema es que la detección es cualitativa y, aunque con el MEIA, se puede obtener un nivel de concentración aparente de digoxina, dicha concentración no puede relacionarse con la gravedad de la intoxicación, puesto que la respuesta no es lineal.

La eliminación de digoxina depende de cada paciente y de la cantidad tomada, algo que no se puede determinar tampoco. Por tanto, lo que se propuso y se está haciendo es recopilar todos los datos de los intoxicados por dicha planta para poder establecer una relación entre la concentración plasmática de oleandrina detectada por MEIA, el cuadro clínico y la gravedad de la posible intoxicación

Moraleja: Las adelfas se miran pero no se «tocan», ni  mucho menos se comen, ¿de acuerdo?

Espero que os haya gustado y gracias por aguantar la lectura. Nos leemos pronto…

Bibliografía:

«Plantas medicinales. El Dioscórides renovado» de P. Font Quer

«El Asno de Oro» de Apuleyo

«Introducción a la Química Terapeútica» A. Delgado Cirilo

Artículo de Farmacia Hospitalaria: Farm. Hosp 2007; 31: 128-136

Revista Clínica Rev. Clin. Esp 2007; 207:535

«La flor del mal» de Janet Ftich.